Бактериальные эндотоксины.

Способы удаления бактериальных эндотоксинов из биологических образцов.

В широком смысле под эндотоксинами понимают бактериальные токсические вещества, которые являются структурными компонентами бактерий. Частным и наиболее упоминаемым эндотоксином являются липополисахариды (ЛПС). Липополисахариды - структурные компоненты мембран грам-негативных бактерий, поддерживающие стабильность мембраны. На одну клетку Escherichia coli приходится около двух миллионов молекул ЛПС. Несмотря на то, что эндотоксины достаточно прочно связаны с мембраной клеток, в процессе деления и смерти бактериальных клеток происходит высвобождение бактериальных эндотоксинов. Присутствие бактериальных эндотоксинов в препаратах, в особенности применяемых для внутривенного введения, представляет собой огромную проблему. Хотя сами по себе эндотоксины не являются токсическими веществами, их попадание в организм активирует иммунную систему - в основном процесс идет через активацию моноцитов и макрофагов - что приводит к высвобождению целого ряда противовоспалительных медиаторов, таких как фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor - TNF), интерлейкины (особенно IL-6 и IL-1) и других агентов. Развитие каскадной противовоспалительной реакцией, сопровождающейся повышением температуры и лихорадкой (так называемый, эндотоксический шок), может привести к летальному исходу.

По сравнению с белками, бактериальные эндотоксины очень стабильны. Их стабильность сохраняется при высоких значениях температур и в широком диапазоне рН.

Работы, описывающие токсический эффект после внутривенного введения растворов, приготовленных из бактериальных культур и не содержащих микроорганизмов, начали публиковать с конца 19-ого века. И количество подобных работ постоянно увеличивалось.

В 1912 году Hort и Penfold стали использовать термин "пирогенный" (pyrogenic) для обозначения растворов, вызывающих лихорадочное состояние. В 1945 году Westphal опубликовал работу, в которой он описывал полисахаридный комплекс, обнаруженный во внешнем слое бактериальной стенки и обладающий пирогенным эффектом.

В последующие годы Westphal опубликовал еще несколько работ, где он продолжал изучать липосахариды из различных энтеробактерий. В последующие годы молекулярная организация эндотоксинов и механизм их воздействия на организм продолжали изучаться.

Бактериальные эндотоксины, также называемые полисахаридами (ЛПС), являются главным компонентом внешней мембраны грам-негативных бактерий (см. рис. 1).

Рисунок 1: Молекулярная модель внутренней и внешней мембран из E. coli K-12
Формы: овалы и прямоугольники представляют сахарные остатки, кружки - полярный рабочие группы различных липидов.
Сокращения: PPEtn (ethanolamine pyrophosphate); LPS (lipopolysaccharide); Kdo (2-keto- 3-deoxyoctonic acid).

Бактериальные эндотоксины состоят из гидрофильного полисахаридного остатка, который соединен ковалентной связью с гидрофобным липидным остатком (липид А) (см. рис. 2).

Липосахариды большинства видов бактерий состоят из трех основных блоков:
- блок О-антигена (O-antigen region),
- олигосахарид сердцевины (core oligosaccharide),
- липид А (lipid A).

О-антиген в основном состоит из последовательности одинаковых олигосахаридов (от трех до восьми моносахаридов каждый), определяющих видовую специфичность и серологическую особенность соответствующей бактерии.
Олигосахарид сердцевины имеет консервативную структуру с внутренней областью 3-дезокси-D-манно-2- октулосоновой кислота (KDO) - гептоза и внешней области состоящей из гексоз. Так, например, среди видов E.coli известно пять разных типов сердцевинной области. Липид А является самой консервативной частью эндотоксина и отвечает за большинство биологических свойств эндотоксина, в том числе, за его биологическую токсичность. Бактериальные штаммы, в составе мембраны которых отсутствовал бы липид А или эндотоксин, не известны современной науке.

Рисунок 2: Химическая структура эндотоксина из E. coli
(Hep) L-glycerol-D-manno-heptose; (Gal) galactose; (Glc) glucose; (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonic acid; (NGa) N-acetylgalactosamine; (NGc) N-acetyl-glucosamine.

Молекулярная масса мономера эндотоксина обычно составляет от 10 до 70 кДа. Но встречаются и отдельные исключения: 2.5 кДа с коротким О-антигеном до 70 кДа с очень длинным О-антигеном. Клетки "теряют" эндотоксины в большом количестве во время своей гибели, а также в процессе роста и деления. Эндотоксины устойчивы к высоким температурам и не разрушаются при стандартных режимах автоклавирования. Эндотоксины можно разрушить только при использовании следующих режимов: 250 °С в течение 30 минут или 180 °С в течение более 3 часов. Применение кислот и щелочей с концентрацией не менее 0.1 М также может привести к разрушению эндотоксинов.

Методы удаления эндотоксинов

Существует целый ряд методов, которые применяют для удаления бактериальных эндотоксинов: ионообменная хроматография, аффинные сорбенты, гель-фильтрация, ультрафильтрация, центрифугирование в градиенте сахарозы, использование системы двухфазного разделения.

Способ удаления определяется масштабами и экономической целесообразностью. Для удаления эндотоксинов из больших объемов обычно используют ультрафильтрацию и ионообменную хроматографию. Ультрафильтрация очень эффективна для удаления эндотоксинов из воды и водных растворов, но совершенно не годится в случаях очистки от эндотоксинов растворов, содержащих белки или нуклеиновые кислоты. Те же недостатки ультрафильтрации относятся и к ионообменной хроматографии. Использование аффинных сорбентов, как правило, иммобилизованных на агарозе, сефарозе, акриламиде и других носителях, является, пожалуй, самым эффективным способом удаления бактериальных эндотоксинов. Основные минусы такого подхода: 1. длительность процесса удаления (необходимо многократно пропускать пробу через колонку, скорость протока при этом не может быть большой, т.к. это приводит к деформации сорбента), 2. разбавление пробы в процессе очистки может быть от 10 до 100-кратной, 3. стоимость аффинного сорбента может быть очень большой.

Двухфазная система разделения является самым дешевым и самым эффективным способом удаления эндотоксинов. Основной принцип этого метода - образование двухфазной мицеллярной системы за счет добавляемого в водный раствор мицеллообразующего полимера. Бактериальный эндотоксин захватывается образующимися мицеллами из водной гидрофильной части и при разделении фаз остается в гидрофобной среде (см. рис. 3).

Рисунок 3: Схема двухфазного мицеллярного разделения, вызванного повышением температуры.
Мицеллы могут присутствовать и в водной фазе, но их размер значительно меньше, чем в нижней гидрофобной части.

Использование трех циклов обработки двухфазной системой позволяет снизить уровень эндотоксинов во всех рекомбинантных белках, получаемых из E. coli, более чем на 99%. При этом биологическая активность и свойства самих белков не претерпевают изменений.
Минус двухфазной системы - в водной фазе после разделения всегда остается некоторое количество добавляемого мицеллообразующего полимера. Некоторые исследователи считают, что примеси этого полимера оказывают негативное влияние при дальнейшем использовании очищенных таким образом препаратов. Другие исследователи опровергают негативное такое негативное влияние. Наш опыт использования препаратов, очищенных от бактериальных эндотоксинов при помощи двухфазной мицеллярной системы, как в системе in vitro, так и in vivo, не показал никаких негативных эффектов ни на клетки, ни на животных, в которые вводили очищенные препараты.
По-видимому, работа с такой системой требует некоторых навыков и их недостаток может проявляться в последующих результатах.

Определение эндотоксинов

Для определения эндотоксинов стандартно применяют LAL тест (LAL: Limulus Amebocyte Lysate). С семидесятых годов этот тест вытеснил применявший ранее так называемый "пирогенный тест", когда испытуемый препарат вводили кроликам. Кролики очень чувствительны к эндотоксинам и их реакция на вводимые препараты долгое время служила индикатором пирогенности.
В настоящее время стал применяться также EAA тест (EAA: Endotoxin Activity Assay). Этот тест разработан компанией Spectral Diagnostics Inc. (www.spectraldx.com) и позволяет выявлять уровень эндотоксинов в крови.
По международной классификации концентрацию эндотоксинов обозначают в EU (endotoxin units): EU/мл или EU/мг. Одна единица (1 EU) приблизительно соответствует 100 пг эндотоксина. Одна бактериальная грам-негативная клетка содержит приблизительно 10-15г или 1 фг эндотоксина, таким образом, 1 EU производят 105 бактерий. 1 мл ночной культуры E. coli содержит от 5·108 до 109 клеток, что соответствует до 10'000 EU на 1 мл культуры.

Максимально допустимый уровень эндотоксина при внутривенном введении - 5 EU на кг тела в течение часа.

По материалам статьи ЗАО "Силекс". Реагенты для удаления эндотоксинов. www.sileks.com